小分子化合物(SMCs)平均分子質(zhì)量小于5000 Da，在免疫化學(xué)中被歸類(lèi)為半抗原。SMCs指的是內源性化合物(如激素)，外源性藥物(如藥物)，或自然和人工環(huán)境污染物(如真菌毒素或農藥)。從環(huán)境和食品安全監測到臨床診斷，監測SMCs需要使用快速和靈敏的監測技術(shù)，以確保最大療效和相關(guān)性。越來(lái)越多研究涉及SMC監測方法，如HPLC(高效液相色譜)，GC(氣相色譜)，LC-MS/MS(液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)，SPR(表面等離子體共振)和其他相關(guān)技術(shù)。雖然這些方法具有很高的靈敏度和特異性，但由于樣品前處理耗時(shí)且復雜，設備昂貴以及需要受過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓的技術(shù)人員，不適用于現場(chǎng)快速檢測?；诳乖?/span>-抗體特異性結合的免疫化學(xué)分析(ICAs)具有價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單、通量高、檢測快速等優(yōu)點(diǎn)。因此，ICAs不僅在前沿研究中非常突出，還能應用于相關(guān)現場(chǎng)檢測。
ICAs有兩種反應模式：競爭和非競爭(圖1)。在某些情況下，SMCs可能受到大小或結構的限制，只具有一個(gè)合適的免疫結合位點(diǎn)，為單表位抗原。競爭ICA反應模式最適合這些靶標SMCs。靶標分析物將與標記的半抗原競爭結合固定濃度的抗體。當該反應達到平衡時(shí)，去除游離半抗原，并監測特異性結合產(chǎn)生的信號，其與靶標分析物濃度成反比。競爭免疫分析法的靈敏度受到抗原抗體親和力的限制，當親和常數(Ka)大于10-12mol/L時(shí)，靈敏度可達到10-12mol/L水平。但抗體的親和常數(Ka)通常小于1010?mol/L，因此，競爭性ICA往往表現出相對較低的靈敏度，使得在靶標濃度非常低的情況下很難區分陰性和陽(yáng)性樣品，難以滿(mǎn)足污染物檢測的基本應用需求。這種模式在靶標低濃度情況下也會(huì )產(chǎn)生較大的誤差，導致準確度、重復性、靈敏度和線(xiàn)性范圍較差。
圖1?競爭性與非競爭性免疫分析的差異
另一方面，非競爭性ICA通常應用于具有多表位的大分子抗原的檢測，常用的非競爭性免疫分析法是夾心ELISA。在夾心ELISA過(guò)程中，使用兩種不同的抗體在靶標分子周?chē)纬蓨A心，其中一種抗體捕獲靶標(捕獲抗體)，另一種抗體被標記(檢測抗體)，能夠產(chǎn)生與靶標物濃度成正比的信號。在非競爭性ICA中，抗原必須是具有多個(gè)表位的多價(jià)抗原，以便能夠同時(shí)與捕獲抗體和檢測抗體結合。
用于監測SMCs的有效非競爭性ICAs的設計依賴(lài)于對關(guān)鍵試劑的適當選擇，如抗體、吸附性載體材料、特異性半抗原標記物。多克隆抗體和單克隆抗體雖然供應豐富且種類(lèi)繁多，但也表現出了一些缺點(diǎn)，有時(shí)靈敏度、親和力、穩定性或種屬特異的識別特征不能滿(mǎn)足應用需求。為了解決這些問(wèn)題，通過(guò)新的生物識別材料(如受體蛋白、重組抗體和適配體)拓寬了該平臺的能力。此外，ICA平臺已經(jīng)開(kāi)始廣泛應用新的標記，如鑭系螯合物、量子點(diǎn)(QDs)和DNA測序，使ICA平臺用于SMCs非競爭性檢測具有可行性。
由于這些新技術(shù)具有更寬的檢測范圍、更高的靈敏度及易于自動(dòng)化的顯著(zhù)優(yōu)勢，因此研究人員專(zhuān)注于開(kāi)發(fā)SMCs的非競爭性分析。迄今為止，基于化學(xué)修飾半抗原和專(zhuān)用分離設備、新型抗體以及其他相關(guān)技術(shù)的非競爭性反應模式的相關(guān)報道較多。本文綜述了六種用于檢測SMCs的非競爭性反應設計：基于生物素-親和素系統的雙表位夾心非競爭性免疫分析(BA-NIA)、基于固相固定化表位的非競爭性免疫分析(SPIE–NIA)、基于抗獨特型抗體的非競爭性免疫分析(AIA–NIA)、基于抗免疫復合物抗體的非競爭性免疫分析(AICA-NIA)、開(kāi)放式夾心非競爭性免疫分析(OS-NIA)和基于標記分析物抗體置換的非競爭性免疫分析(DLA-NIA)。綜述了六種設計方法的基本原理和應用現狀。
1.基于生物素-親和素系統的雙表位夾心非競爭性免疫分析(BA-NIA)
BA-NIA技術(shù)由Ishikawa首先提出并應用于小分子多肽。由于SMCs的表位單一，傳統的雙位點(diǎn)ICAs無(wú)法檢測。這種非競爭性設計依賴(lài)于使用強親和系統，即生物素-親和素復合物，與分析物共價(jià)連接來(lái)獲得兩個(gè)位點(diǎn)的免疫檢測。檢測原理是用適當的物質(zhì)標記待測半抗原，修飾的半抗原可以同時(shí)結合標記識別元件和抗體，從而實(shí)現雙位點(diǎn)非競爭性分析。具體來(lái)說(shuō)，靶標分析物被生物素化，能夠配對結合形成復合物，例如固相吸附的親和素類(lèi)似物和可檢測的標記抗體。這樣，SMCs可以通過(guò)夾心非競爭性免疫分析法進(jìn)行檢測。具體反應步驟如下(圖2):1)將靶標分析物與生物素結合，從而產(chǎn)生一個(gè)體積更大的復合物，該復合物也具有第二個(gè)表位。2)生物素化分析物經(jīng)免疫親和柱純化后與標記抗體混合。3)將混合物轉入預包被親和素的酶標板，進(jìn)行夾心非競爭性反應。4)最后，記錄信號強度，觀(guān)察到信號強度與靶標分析物濃度呈正相關(guān)。
圖2?生物素親和素體系雙表位夾心非競爭性免疫分析方案
Ishikawa首次用血管緊張素I證明了這一原理的可行性，血管緊張素I是一種由10個(gè)氨基酸組成的單鏈肽，也可歸為小分子半抗原。將血管緊張素I生物素化，然后用抗血管緊張素I Fab'-HRP偶聯(lián)物和鏈霉親和素包被聚苯乙烯微球進(jìn)行夾心反應模式。血管緊張素I的檢測限(LOD)為10 amol(13 fg)，比使用相同抗體的ICA應用低100倍。在另一篇文章中，描述了一種應用這種設計來(lái)檢測血漿中精氨酸加壓素類(lèi)似結構的免疫分析法。LOD為11 fg(10 amol)，比使用相同抗血清的競爭性測定低45倍。符合SMC半抗原的氨基也可以通過(guò)L-甲狀腺素(T4)實(shí)驗進(jìn)行檢測，將T4生物素化，并通過(guò)應用這種設計進(jìn)行檢測，使靈敏度增加50倍，LOD為78 fg(0.1 fmol)/管。根據之前的報道，在BA-NIA平臺上開(kāi)發(fā)和優(yōu)化了高靈敏度、非競爭性的ICA。通過(guò)免疫復合物形成過(guò)程中反復靶向結合反應，可顯著(zhù)減少非特異性信號。此外，靶標分析物在選擇性結合步驟中富集，提高了靈敏度。[Arg8]-加壓素(AVP)是另一種SMC，采用非競爭性免疫分析法檢測。將AVP生物素化，并與2,4-二硝基苯熒光素二硫-BSA-兔抗AVP IgG偶聯(lián)物反應。熒光法測定結果，LOD為1.1 fg(1 amol)/管。在另一實(shí)驗中，采用BA-NIA設計檢測血漿中α-人心房鈉肽(α-hANP)。α-hANP被生物素化，并與IgG涂層的聚苯乙烯微球結合。經(jīng)洗滌后，該復合物與2,4-二硝基苯熒光素-BSA-二硫化物-兔抗α-hANP IgG偶聯(lián)物反應。該復合物被進(jìn)一步捕獲在IgG包被的聚苯乙烯微球上，與親和素-β-D-半乳糖苷酶偶聯(lián)反應。然后，將復合物依次轉移到抗熒光素IgG包被聚苯乙烯微球和IgG(抗兔IgG)包被聚苯乙烯微球上。最后，經(jīng)過(guò)4次洗滌以減少干擾并濃縮分析物，熒光法測定結果，LOD為3 fg(1 amol)/管。在這個(gè)BA-NIA過(guò)程中，生物體液中蛋白質(zhì)和其他基質(zhì)的干擾可以通過(guò)使用分子篩從蛋白質(zhì)中分離分析物來(lái)消除。BA-NIA方案可適用于半抗原(包括多肽)的測定，這些半抗原可被衍生化，從而同時(shí)被抗半抗原抗體和親和素分子結合。該BA-NIA方法靈敏度高，可用于SMCs的夾心免疫檢測。
2.固相固定表位非競爭性免疫分析(SPIE-NIA)
SPIE-NIA最初由Pradelles提出用于SMC。這種非競爭性多步驟程序基于捕獲抗體和檢測抗體相繼識別的單個(gè)表位，涉及分析物與固相的共價(jià)交聯(lián)；原理示意圖如圖3所示。
圖3?基于固相固定化表位的非競爭性免疫分析方案
在這種方法中，固定化抗體和標記抗體可以是相同的。因此，在這種夾心結構中，無(wú)需篩選可以結合分析物不同表位的不同抗體。具體方法如下:1)用固定化抗體捕獲半抗原分析物(標準物或樣品)。2)用雙功能試劑將半抗原中的氨基或其他基團(如戊二醛、次酸二丁二酰亞咪酯、羰基二咪唑等)生物偶聯(lián)到固定化抗體上。3)生物偶聯(lián)后，通過(guò)酸性、堿性或有機溶劑處理，使半抗原分析物在變性條件下從固定化抗體中釋放出來(lái)。因此，表位被釋放，半抗原被釋放到溶劑中。4)釋放的半抗原通過(guò)共價(jià)鍵與固定化抗體結合。釋放的表位可以被酶標抗體重新識別。通過(guò)酶活性監測結果。在對SMCs的SPIE-NIA的初步研究中，主要關(guān)注具有活性氨基的SMCs，這些氨基可以與固定化抗體進(jìn)行生物偶聯(lián)。Pradelles報道了一種新的基于酶的免疫測定方法，可以測定三種含有伯氨基的小半抗原(甲狀腺素，MW 777;物質(zhì)P，MW 1347;內皮素，MW 2492)。戊二醛和二丁二酰亞酯作為同雙官能團試劑。這些分析物的LOD為4-10 fmoL/mL，比傳統的競爭ICAs靈敏度高70-200倍。白三烯C4(L TC4)有一個(gè)活性氨基，SPIE-NIA采用戊二醛交聯(lián)生物偶聯(lián)法檢測LTC4，LOD為2 pg/mL。將SPIE-NIA設計應用于血管緊張素II，獲得的結果靈敏可靠，LOD為0.5 pg/ml，CV值在2-100 pg/ml范圍內低于15%。上述方法主要依賴(lài)于單克隆抗體，而多克隆抗體也適用于SPIE-NIA。一種應用于七肽BN 52080的SPIE-NIA使用多克隆抗體進(jìn)行檢測，肽首先與吸附到固相的多克隆抗體免疫結合。然后，進(jìn)行共價(jià)固定，使用NaOH使戊二醛從抗體結合部位釋放。與固相相連的肽進(jìn)一步用由親和層析純化的與乙酰膽堿酯酶偶聯(lián)的相同抗體組成的示蹤劑定量。該方法的檢出限為10 pg/mL，比使用相同抗體的酶免疫法靈敏度高5倍。如前所述，這些是基于氨基使用化學(xué)或生化試劑進(jìn)行交聯(lián)的新型SPIE-NIA。對于不含氨基的分析物，生物偶聯(lián)需要一個(gè)預衍生化步驟。在SPIE-NIA監測無(wú)氨基的甲狀腺素(TRH)時(shí)，首先用重氮APEA衍生標準TRH或生物樣品，引入活性基團。然后使用乙酰膽堿酯酶標記的TRH單克隆抗體對靶標分析物進(jìn)行監測，LOD為0.1 pmoL/mL，靈敏度提高了26倍。除了化學(xué)和生化偶聯(lián)外，紫外線(xiàn)輻射也被報道為偶聯(lián)的另一種方法。在l-甲狀腺素SPIE-NIA的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，l-甲狀腺素被紫外直接光活化，與結合蛋白形成共價(jià)交聯(lián)。該技術(shù)進(jìn)一步成功應用于L-甲狀腺素的檢測。經(jīng)紫外線(xiàn)照射和甲醇處理后，用乙酰膽堿酯酶標記的抗L-甲狀腺素抗體檢測共價(jià)連接的L-甲狀腺素，LOD為4.8 nmol/L。然而，本研究表明，在共價(jià)光交聯(lián)過(guò)程中，靶標的氨基參與了反應。文獻中也報道了直接紫外線(xiàn)照射不含氨基的半抗原：使用紫外線(xiàn)照射將17-雌二醇直接交聯(lián)到抗體上。交聯(lián)效率與輻照能量和波長(cháng)直接相關(guān)。該檢測特異性好(與其他天然類(lèi)固醇無(wú)交叉反應)、準確度高、靈敏度高(人血清LOD為38 pg/mL)。光交聯(lián)是一個(gè)復雜的步驟，不同的反應體系可能會(huì )產(chǎn)生不同的結果。自由基傾向于與周?chē)h(huán)境發(fā)生反應，這可能導致零長(cháng)度交聯(lián)。羥基自由基(OH?)被認為是一種強大的原子抽提劑。OH?是用Fenton亞鐵(Fe2+)試劑原位制備的，它促進(jìn)了photo-SPIE-NIA的交聯(lián)。其他過(guò)渡金屬，如Cu2+，也被用來(lái)通過(guò)Fenton化學(xué)生成自由基。利用類(lèi)Fenton反應產(chǎn)生的自由基，開(kāi)發(fā)了一種新的SPIE-NIA程序(SPIE-Rad)。該方法成功應用于17-β-雌二醇，以抗雌二醇單克隆抗體為捕獲抗體，與fenton類(lèi)試劑交聯(lián)，在人血清中LOD為5 ng/L。
3.基于抗獨特型抗體的非競爭性免疫分析(AIA-NIA)
AIA-NIA最早是由Kohen團隊提出的。這種抗獨特型抗體(Ab2)可以結合抗體(Ab1)可變區的抗原決定簇。不同的結合親和力取決于重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區的氨基酸序列?？躬毺匦涂贵w有Ab2α和Ab2β兩種。Ab2α可以結合抗體可變區框架區，該可變區距離Ab1的結合位點(diǎn)相對較遠；這并不影響Ab1與抗原的結合。Ab2β可結合在Ab1與抗原復合物的位置附近，有效阻斷Ab1對抗原的識別。AIA-NIA原理如圖4所示。2)加入Ab2β阻斷Ab1多余的結合位點(diǎn)。3)加入標記的Ab2α可捕獲Ab1/抗原復合物，而Ab2α由于空間位阻不能捕獲Ab2β/Ab1復合物。4)根據與Ab1/抗原復合物結合的標記Ab2α的數量監測信號強度。
圖4?抗獨特型抗體非競爭性免疫分析方案
這種類(lèi)型的AIA-NIA也可稱(chēng)為選擇性抗體系統，其中Ab2α作為選擇性抗體起作用。Barnard報道了一種新的非競爭性SMC免疫分析方法，將該原理應用于直接測定血清中的雌二醇。兩種類(lèi)型的抗獨特型抗體識別特異性一抗(例如，抗雌二醇)的高變區內的不同表位。使用這些匹配的抗體(一抗、α型和β型)已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一種不基于傳統的雙位點(diǎn)分析來(lái)確定抗體占用的方法。該方法具有良好的靈敏度、準確性和與其他競爭性免疫測定方法的可比性。如今，AIA-NIA已應用于不同的小分子分析物，包括雌二醇(LOD:28 pg/mL)、皮質(zhì)醇(LOD:90 pg =248 fmol)和脫氧鎳黃醇等。在開(kāi)發(fā)AIA-NIA方法時(shí)，α和β獨特型抗體Ab2α和Ab2β配對抗體的生產(chǎn)是第一步，也是最困難的一步。此外，陽(yáng)性克隆效率很低，抗體同型和篩選復雜，限制了AIA-NIA方法的開(kāi)發(fā)和應用。
4.基于抗免疫復合物抗體的非競爭性免疫分析法(AICA-NIA)
半抗原(如短肽或藥物)的免疫分析通?；诟偁幱邢迶盗靠贵w上的結合位點(diǎn)的原則。由于抗原體積小，兩個(gè)特異性抗體不能同時(shí)結合一個(gè)半抗原。然而，據報道，含有抗異型抗體的抗血清可以結合免疫復合物。因此，提出了一種基于抗免疫復合物抗體的新方法，即新型抗體與一種抗體/抗原復合物形成后產(chǎn)生的新表位結合。這種新型抗體被稱(chēng)為抗異型抗體，最初由Voss等人提出，這種抗異型抗體特異性地識別抗原/抗體復合物，同時(shí)對原始抗原或抗體分子不表現出親和力。這種性質(zhì)可用于開(kāi)發(fā)雙位點(diǎn)非競爭性ICAs；AICA-NIA的反應原理如下(圖5):2)在每個(gè)孔中加入樣品或標準品，進(jìn)行抗原抗體結合，形成免疫復合物。3)加入標記物標記好的抗異型抗體(Ab2)，與抗原抗體復合物結合。
圖5?基于非競爭性免疫分析的免疫復合物抗體方案
這種雙位點(diǎn)非競爭性SMCs方案被應用于開(kāi)發(fā)血清中地高辛的檢測方法。結果表明，該方法簡(jiǎn)便、快速(培養時(shí)間1~10 min)、靈敏度高(LOD 30 ng/L)，且不受地高辛結構類(lèi)似物的干擾。此外，對于血管緊張素II的夾心檢測，開(kāi)發(fā)了一種基于免疫復合物抗體的新檢測方法。Towbin報道了能夠與八肽血管緊張素II形成三元復合物的單克隆抗體對(LOD為1 pg/mL)。在AICA-NIA中，首先也是最重要的是獲得抗免疫復合物抗體。制備這些抗體是相當困難和耗時(shí)的，通常需要用抗體或分析物抗體復合物進(jìn)行免疫，由于抗原與抗體結合后免疫復合物的微小變化，這些方法很少成功。此外，考慮到超過(guò)85%的抗原和抗體分子的復合物潛在表位最終將有效地嵌入免疫復合物中，因此難以預測復合物結構上有效和可靠的結合位點(diǎn)，免疫復合物不能被準確地識別。為了避免這些問(wèn)題，噬菌體抗免疫復合物試驗(PHAIA)技術(shù)被用于抗異型抗體的生產(chǎn)，這可能有利于小分析物的非競爭性分析。在該技術(shù)中，噬菌體展示庫被用于分析物-抗體免疫復合物的選擇。噬菌體克隆用于識別免疫復合物而不是游離抗體，是二級結合試劑。HRP標記的抗噬菌體抗體產(chǎn)生信號，除HRP外，還采用DNA進(jìn)行噬菌體抗免疫復合物實(shí)時(shí)PCR (PHAIA-PCR)檢測SMCs。Hee-Joo Kim報道了PHAIA技術(shù)，其中顯示在M13噬菌體表面的短肽環(huán)與抗體-分析物復合物特異性結合。編碼該肽的噬菌體DNA可通過(guò)PCR擴增。這種方法省略了半抗原功能化或DNA模板的生物偶聯(lián)，同時(shí)提高了靈敏度。經(jīng)驗證，PHAIA-PCR比傳統PHAIA靈敏度高10倍，并且使用磁珠快速分離反應物的速度更快。在PHAIA技術(shù)的基礎上，采用AICA-NIA技術(shù)對孔雀石綠(MG)、白孔雀石綠(LMG)、氯馬松、阿特拉津、除草劑氯馬松、3-苯氧基苯甲酸、溴化二苯醚、禾草特、阿特拉津、真菌毒素進(jìn)行了檢測。自主多樣化庫(ADLib)系統支持PHAIA技術(shù)，是生產(chǎn)免疫復合物抗體的一種極好的替代技術(shù)。ADLib系統可以從雞B細胞系DT40顯示的免疫球蛋白M (IgM)文庫中快速篩選和體外分離抗原特異性單克隆抗體(mAbs)?；?/span>ADLib系統的新應用，開(kāi)發(fā)了抗異型抗體，并應用于血清樣本中雌二醇(E2)和25-羥基維生素D[25(OH)D]的檢測。E2的LOD為3.13 pg/mL，25(OH)D為2.1 ng/mL。與競爭性ELISA相比，靈敏度顯著(zhù)提高。
5.開(kāi)放式夾心非競爭性免疫分析(OS-NIA)
OS-NIA是一種新型的非競爭性檢測技術(shù)，可用于SMCs的非競爭性檢測。該方案的優(yōu)點(diǎn)在于其適用性與靶標分析物的分子量無(wú)關(guān)。在異相免疫分析中，OS-NIA方法是由Ueda首先提出的。觀(guān)察到，來(lái)自特定抗體可變結構域的自由VH和VL鏈的結合力較弱；在沒(méi)有抗原的情況下，VH和VL是分離的。然而，在抗原存在的情況下VH和VL鏈會(huì )在強作用力下結合，抗原作為橋梁，增強了結合的親和力和穩定性?；谶@一現象，設計了OS-NIA步驟。原理如圖6所示，具體流程如下:1)將VL鏈與載體蛋白偶聯(lián)，固定在ELISA板上。2)非競爭反應添加靶標分析物和標記的VH鏈。分析物作為“橋梁”，VH和VL具有較強的結合。
圖6?開(kāi)放式夾心非競爭性免疫分析方案
在Ueda的研究中，描述了基于單區域分離的VL和VH鏈之間相互作用的免疫分析，在抗原的存在下，這些鏈重新結合?？闺u蛋溶菌酶(HEL)抗體HyHEL-10的VL片段固定在微孔板上。樣品與M13顯示的VH鏈共孵育，并用過(guò)氧化物酶標記的M13抗體進(jìn)行檢測。信號檢測與樣品中HEL含量成正比，LOD靈敏度為15 ng/mL。此外，Ueda等人為了監測與糖尿病和阿爾茨海默病等幾種疾病過(guò)程相關(guān)的一種重要的氧化生物標志物，13(R,S)-羥基-9(E)，11(E)-十八碳二烯酸(13-(E,E)-HODE)，在M13噬菌體上顯示雜交瘤1213-1產(chǎn)生的抗體的抗原結合片段，并對抗體可變區基因進(jìn)行分析，其LOD為2.2 nM，而競爭性ELISA為15.6 nM。目前，該方法已成功應用于雌激素真菌毒素玉米赤霉烯酮、貝類(lèi)毒素、雌二醇、甲狀腺激素T4、皮質(zhì)類(lèi)固醇、苯甲醛的檢測。在另一項研究中，抗體可變區(VH和VL結構域)的抗原依賴(lài)性穩定被提出用于半抗原的定量。從4-羥基-3-硝基苯乙酰(NP)抗體中獲得了高親和力突變體VH結構域和VL結構域兩個(gè)融合蛋白。當這些融合蛋白添加在一起時(shí)，在NP存在的情況下實(shí)現了再結合，信號的產(chǎn)生與NP濃度直接相關(guān)，并且比競爭性免疫分析具有更好的靈敏度。在用于檢測玉米赤霉烯酮(ZEA)的OS-NIA中，研究者將ZEA單抗的VH和VL?cDNAs克隆到分裂Fv噬菌體pKST2上，結果分別在M13噬菌體p9和p7上顯示了VH和VL片段。成功地檢測了ZEA，其檢出限和檢測范圍均比同類(lèi)檢測方法更廣。OS-NIA方法也可以適用于標記DNA，通過(guò)使用重組融合蛋白的免疫聚合酶鏈反應產(chǎn)生信號。在這個(gè)實(shí)驗中，骨相關(guān)疾病的生物標志物，麥芽糖結合蛋白融合VH(MBP-V(H))的抗體識別人骨鈣素的c端片段被固定在微孔板上。將同一抗體的鏈霉親和素(SA)融合的VL與游離骨鈣素一起加入，所有試劑一起孵育。實(shí)時(shí)PCR檢測結果LOD為100 fg/mL。也有一些無(wú)標記的OS-NIA方法報道用于檢測各種SMC。這是利用場(chǎng)效應檢測來(lái)自單個(gè)抗體可變區域的分離VL和VH鏈的抗原依賴(lài)性鏈間相互作用引起的內部分子電場(chǎng)變化。將VH鏈和小抗原雙酚A引入固定化VL鏈可以直接進(jìn)行電檢測。此外，在VL鏈上加入帶負電荷的異硫氰基-EDTA可將檢測限改善至1 pM。這種無(wú)標簽方式可以基于捕獲靶標分子直接反應電荷密度的變化。在均相OS-NIA方法中，無(wú)需重復孵育和洗滌步驟即可完成反應過(guò)程。因此，檢測時(shí)間可以大幅度縮減。用OS-NIA對抗體可變區進(jìn)行抗原依賴(lài)性結合，用于檢測4-羥基-3-硝基苯乙酰(NP)。監測兩個(gè)融合蛋白的重新結合，一個(gè)抗4-羥基-3-硝基苯乙酰(NP)抗體VH融合到β-半胱氨酸N端缺失突變體(VH?βα)，和VL融合到β-半胱氨酸C端缺失突變體(VL?δ?ω)。在簡(jiǎn)單的試劑與樣品混合后，觀(guān)察到抗原(NP)依賴(lài)性的酶活性增加。與相應的異相免疫吸附試驗相比，靈敏度提高了約1000倍，這可能是由于VH-VL結合的背景值較低利用熒光共振能量轉移(FRET)在熒光標記的VH和VL片段之間監測了抗雞蛋溶菌酶(HEL)抗體HyHEL-10可變區抗原依賴(lài)的穩定性。分別用熒光素琥珀酰亞胺酯和羅丹明-X標記VH和VL片段，在冷卻的試管中混合，監測加入抗原后熒光光譜的變化。在另一項工作中，兩個(gè)融合蛋白的重新結合，VH片段連接到β-半乳糖的N端缺失突變體VHδ?α，VL片段連接到β -半乳糖的C端缺失突變體VL?δ?ω，通過(guò)兩者之間的酶互補來(lái)監測。為了優(yōu)化實(shí)驗，連接每個(gè)融合蛋白的兩個(gè)結構域的連接臂的長(cháng)度是不同的；優(yōu)化后的VH/VL對由于低VH/VL濃度和背景異源二聚體結合而使靈敏度提高了1000倍。這種分析基本上是基于分離的VH和VL鏈之間的不同相互作用，存在或不存在抗原。這種OS-NIA方法需要構建編碼VH和VL蛋白序列的DNA片段。此外，表達和純化步驟復雜，并不是所有抗體分離的VH/VL在抗原存在時(shí)都表現出結合能力增強的特點(diǎn)，這限制了該方法的應用。噬菌體抗體庫因其容量大，被認為是制備高親和力、高特異性抗體的有效技術(shù)。在沒(méi)有抗原的情況下，應用分子定向轉化技術(shù)減弱VH與VL的結合能力，通過(guò)提高信噪比提高靈敏度。
6.基于標記分析物的非競爭性免疫分析法(DLA-NIA)
DLA-NIA是由Giraudi首次提出用于SMC分析物的檢測。原理如圖7所示:2)使用阻斷劑占據分析物中多余的抗體結合位點(diǎn)。4)最后，標記后的分析物信號強度與分析物濃度呈正相關(guān)。
圖7?基于非競爭性免疫分析的標記分析物/抗體置換方案
Giraudi的方法基于“多齒配體”(皮質(zhì)醇-聚(l-賴(lài)氨酸)綴合物)的使用，能夠阻斷未被分析物占據的抗體位點(diǎn)。用酶標記分析物(皮質(zhì)醇-HRP)替代抗體結合分析物后，直接監測分析物結合位點(diǎn)。觀(guān)察到的信號與分析物濃度呈直接的線(xiàn)性相關(guān)。研究了分析物和多齒配體與特異性抗體之間的相互作用特性，以對皮質(zhì)醇的非競爭性免疫分析進(jìn)行初步評估。將非競爭性測定法與在相同條件下使用相同試劑獲得的競爭性免疫測定法進(jìn)行比較。實(shí)驗結果表明，非競爭性模式的檢出限較低(0.15 ng/mL而不是0.72 ng/mL)。針對黃曲霉毒素(AFB1+AFB2+AFG1+AFG2)的檢測，本文描述了一種廣譜捕獲、非競爭性的AFB1多克隆檢測抗體檢測方法。該方法基于用AFB1蛋白偶聯(lián)物阻斷捕獲抗體的游離位點(diǎn)，然后用酶標記的AFB1取代抗體結合的AFs。AFB1-HRP偶聯(lián)物對弱結合AFB1同源物的取代速度比AFB1快，因此，交叉反應物的測定信號更高，幾乎與AFB1濃度線(xiàn)性相關(guān)。利用酪蛋白、卵清蛋白和牛血清白蛋白等不同的蛋白質(zhì)制備AFB1偶聯(lián)物，并研究了它們的結合效率，本方法對AFs的檢出限為5 pg/孔(0.1μg/L)。Lates等人報道了一種新的檢測赭曲霉毒素A (OTA)的方法，基于其脫氯類(lèi)似物赭曲霉毒素B (OTB)在置換免疫分析法中的使用。將OTB固定在微孔玻璃微珠上，結合抗OTA抗體，以抗IgG抗體過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物為標記。通過(guò)這種方法，獲得了一種初始的生物傳感材料。當這種材料與OTA一起孵育時(shí)，毒素會(huì )與OTB競爭抗OTA抗體的結合位點(diǎn)，并將抗體標記的過(guò)氧化物酶復合物釋放到溶液中。這種新開(kāi)發(fā)的RLAB-NIA方法與SMC檢測具有相似的檢測限和檢測時(shí)間。綜上所述，本文全面回顧了目前對SMCs的新型非競爭性免疫測定方法的認識。雖然傳統的競爭性檢測方法可以用于SMC檢測，但靈敏度可能不足以適用于特定的應用。借助新穎的非競爭性設計，能夠以更高的靈敏度檢測SMCs。本文討論了6種不同反應設計(BA-NIA, SPIE-NIA，AIA-NIA，AICA-NIA，OS-NIA和DLA-NIA)的非競爭性研究，重點(diǎn)是SMCs的分析和高靈敏度檢測。值得注意的是，最近的文獻注重方法的靈敏度。一些污染性靶標SMCs通常處于復雜的基質(zhì)中。去除干擾后，SMCs檢測的靈敏度和特異性顯得尤為重要。非競爭性免疫分析可能被廣泛應用于不同的多通路和高通量的靶標分析物篩選。在未來(lái)，將應用新的和改進(jìn)的技術(shù)來(lái)增強非競爭性免疫化學(xué)檢測SMCs的新反應模式。丹大深耕原料研發(fā)，堅持自主創(chuàng )新
丹大生物深耕體外診斷原料自主研發(fā)，堅持自主創(chuàng )新，擁有成熟的體外診斷及生命科學(xué)領(lǐng)域上游關(guān)鍵原材料研究與生產(chǎn)平臺，包括小分子定向偶聯(lián)技術(shù)、抗體研發(fā)與生產(chǎn)、蛋白質(zhì)工程技術(shù)、酶分子工程技術(shù)、核酸合成與修飾、引物探針合成、基因合成與測序等。核心產(chǎn)品涵蓋POCT系列、生化系列、化學(xué)發(fā)光系列，其中治療藥物濃度檢測（TDM)系列為特色創(chuàng )新產(chǎn)品。歡迎關(guān)注。